Un multímero es una proteína formada por varias subunidades proteicas, denominada oligómero cuando estas subunidades son pocas.
De esta forma, un multímero es el nombre dado a una proteína que presenta estructura cuaternaria.
Muchas proteínas, especialmente aquellas con pesos moleculares elevados, presentan estructura cuaternaria, esto significa que están formadas por varias cadenas polipeptídicas (desde dos a centenares de ellas). Cada una de estas cadenas se denomina subunidad, y la unión de varias subunidades es lo que hemos llamado multímero, o proteína multisubunidad.
En un complejo proteico estas subunidades pueden ser idénticas o bastante diferentes. Las proteínas con pocas subunidades se denominan oligómeros. Los oligómeros están formados por protómeros (unidades de repetición estructural en proteínas multiméricas que pueden estar formadas por una o varias subunidades). Un gran número de proteínas oligoméricas contienen dos o cuatro subunidades protoméricas, denominadas dímeros y tetrámetros respectivamente.
La asociación de subunidades proteicas puede servir para una gran diversidad de funciones.
Muchos multímeros tienen funciones reguladoras; la unión de pequeñas moléculas puede alterar la interacción entre subunidades produciendo grandes cambios en la actividad de la proteína en respuesta a pequeños cambios en la concentración de sustrato o moléculas reguladoras. Las proteínas reguladoras impiden que se lleven a cabo reacciones metabólicas, por ejemplo, cuando estas no sean necesarias (por ejemplo, no se sintetizarán ácidos grasos a partir de glucosa cuando la célula requiera mucho aporte energético. Todo esto está regulado por los moduladores o proteínas reguladoras, muchas son multímeros).
En otros casos, las diferentes subunidades de un mismo multímero pueden llevar a cabo funciones separadas aunque relacionadas, tales como la catálisis y la regulación. Esto resulta de gran utilidad para la célula, ya que se suprime la necesidad de tener dos proteínas (una para la regulación y otra para la catálisis) juntando todo el proceso en una única proteína multimérica. Así esta proteína podrá autorregular la reacción que catalice, ahorrando espacio y aumentando la eficiencia celular.
Algunas asociaciones, como por ejemplo las proteínas fibrosas (colágeno) y las proteínas de cubierta de los virus, llamadas cápsides, tienen principalmente una función estructural, por tanto mantienen la conformación de la célula, y en el caso de los virus protegen la información genética del exterior.
Algunas estructuras proteicas son el sitio donde tienen lugar reacciones complejas con diversos pasos. Por ejemplo, cada uno de los ribosomas, lugar donde se produce la síntesis de proteínas, incorpora docenas de subunidades de proteínas junto con varias moléculas de RNA. Cada una de estas subunidades proteicas tiene una función específica en el proceso de la síntesis de proteínas: unión al mRNA, fijación de los tRNA, catalizador de la reacción de condensación para la formación del enlace peptídico entre aminoácidos, etc.
La hemoglobina fue la primera proteína oligomérica de la que se determinó la estructura tridimensional. Está formada por cuatro cadenas polipeptídicas y cuatro grupos prostéticos hemo, en los que los átomos de hierro se encuentran en el estado ferroso (Fe2+). La parte proteica, la globina, está constituida por dos cadenas α (de 141 residuos cada una) y dos cadenas β (de 146 residuos cada una). Las letras griegas α y β no se refieren a estructuras secundarias.
En la derecha de la pantalla se puede apreciar la proteína hemoglobina con sus cuatro subunidades, y un átomo de hierro (Fe) en el interior de cada subunidad. Se trata de una molécula de vital importancia ya que es la responsable del abastecimiento de oxígeno a las células del cuerpo.
La hemoglobina se concentra en los hematíes o glóbulos rojos, que son células sanguíneas compuestas por millones de hemoglobinas, y que, por tanto, permiten fijar millones y millones de moléculas de oxígeno provenientes de los pulmones para abastecer las necesidades energéticas de las células del cuerpo.
Es importante destacar que las subunidades de los multímeros presentan generalmente (aunque no siempre) distintas organizaciones en formas específicas (patrones de simetría), dando lugar a simetría proteica.
Por ejemplo, las subunidades de hemoglobina están dispuestas en pares simétricos, con una subunidad α y una subunidad β cada uno.
Existen dos tipos de multímeros: Aquellos que presentan asociación entre cadenas polipeptídicas idénticas o casi idénticas (homotípicos) y aquellos que presentan interacciones entre subunidades con estructuras muy distintas (heterotípicos).
Estos son aquellos cuyas subunidades son idénticas o casi idénticas.
Las subunidades de estos multímeros se mantienen unidas mediante los mismos enlaces que estabilizan la estructura terciaria y que se describirán más adelante: puentes salinos, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas y a veces enlaces covalentes disulfuro.
Cada subunidad es una unidad asimétrica en el agregado, pero la estructura cuaternaria global de la proteína puede ofrecer una amplia variedad de simetría proteica en función de la geometría de las interacciones.
Un ejemplo de multímero homotípico sería la hemoglobina, que se ha descrito anteriormente.
Cabe destacar que los multímeros homotípicos con únicamente dos subunidades se denominan homodímeros. En la imagen de la derecha podemos apreciar un multímero formado por dos subunidades iguales, por tanto un homodímero).
Estos son los que tienen varias subunidades con formas diferentes. En ocasiones, pueden tener una docena o más subunidades distintas.
Las interacciones que mantienen unidas estas subunidades son del mismo tipo que las descritas para los multímeros homotípicos: fuerzas no covalentes (excepto enlaces covalentes disulfuro) en las superficies proteicas complementarias.
Un ejemplo sencillo de multímero heterotípico es el de la proteína BPTI, el inhibidor de la tripsina pancreática bovina. Recibe este nombre porque se une al centro activo de la enzima tripsina formando un complejo fuerte y específico, inhibiendo de este modo la actividad proteolítica de la tripsina en el páncreas. Esta unión es un ejemplo de multímero heterotípico ya que el complejo BPTI-tripsina está formado por dos subunidades unidas fuertemente pero muy distintas estructuralmente.
Hay que tener en cuenta que los multímeros heterotípicos que tienen sólo dos subunidades se denominan heterodímeros. En la imagen de la derecha podemos apreciar un multímero formado por dos subunidades de diferente estructura tridimensional (subunidades distintas), por tanto un heterodímero).
Las subunidades polipeptídicas se ensamblan y se mantienen unidas por interacciones no covalentes, como:
Como con el plegamiento proteico, el efecto hidrófobo es claramente el más importante, ya que las superficies de unión complementarias entre las subunidades son semejantes a las observadas en el interior de los dominios de las proteínas globulares.
Aunque son menos numerosos, los encruzamientos covalentes estabilizan significativamente determinadas proteínas con varias subunidades.
Entre los ejemplos más destacados se encuentran los puentes disulfuro de las inmunoglobulinas y los enlaces de desmosina y lisinorleucina en determinadas proteínas del tejido conjuntivo.
Los encruzamientos de desmosina conectan cuatro cadenas polipeptídicas en la proteína elastina del tejido conjuntivo, semejante a la goma. Se forman como consecuencia de diversas reacciones que implican la oxidación de las cadenas laterales de lisina.
Se produce un proceso semejante en la formación de lisinonorleucina, una estructura encruzada que se encuentra en la elastina y el colágeno.
Con mucha frecuencia, las interacciones entre las subunidades están afectadas por la unión de ligandos. En el alosterismo, el control de la función proteica mediante la unión de ligandos, la unión de un ligando a un lugar específico en una proteína, desencadena un cambio conformacional que altera su afinidad por otros ligandos. Los cambios conformacionales inducidos por el ligando en esas proteínas se denominan transiciones alostéricas, y los ligandos que las desencadenan efectores o moduladores.
Los efectos alostéricos pueden ser positivos o negativos, dependiendo de si la unión del modulador aumenta o disminuye la afinidad de la proteína por otros ligandos.
Uno de los ejemplos de efecto alostérico mejor conocido es la unión reversible del O2 y otros ligandos a la hemoglobina. (Las enzimas alostéricas desempeñan un papel clave en el control de los procesos metabólicos).
A pesar del énfasis dado hasta ahora a las fuerzas que estabilizan la estructura proteica, debe reconocerse que la función proteica requiere cierto grado de flexibilidad. El significado de la flexibilidad conformacional (fluctuaciones continuas, rápidas de la orientación precisa de los átomos en las proteínas) se ha descubierto al investigarse las interacciones proteína-ligando.
La función proteica suele implicar la apertura y el cerrado rápido de cavidades de la superficie de la molécula. La velocidad a la que las enzimas catalizan las reacciones está limitada en parte por la rapidez con la que pueden liberarse del lugar activo las moléculas producto. Cabe recordar que la transferencia de información entre las biomoléculas se produce cuando las moléculas con superficies complementarias precisas interaccionan en un proceso de interacciones no covalentes. La transferencia de información entre las moléculas siempre supone modificaciones de la estructura tridimensional.
Por ejemplo, las conformaciones de las subunidades de las moléculas de hemoglobina que unen O2 experimentan cambios estructurales específicos al unirse o separarse de las moléculas de oxígeno. Este ejemplo se observa en la animación de la derecha, donde, cuando aparece el término deoxy se visualiza la hemoglobina sin moléculas de O2, en cambio, cuando aparece el término oxy, se visualiza la hemoglobina oxigenada, el complejo hemoglobina-oxígeno. Sólo se visualiza la unión de un O2 ya que el lugar de unión del O2 con cada subunidad se encuentra e el interior de estas (donde está la molécula de Fe).
Viendo la animación se aprecia la vital importancia que tiene el cambio de conformación de las proteínas que tiene lugar en la interacción con sus ligando s. Este cambio viene provocado por la simple unión del ligando a la proteína, ya que le induce un cambio de forma debido a la nueva formación de enlaces. Aunque estos desaparecen una vez el ligando se desprende de la proteína, que vuelve a su forma inicial.
Este proceso de cambio conformacional se produce en muy poco tiempo (ya que se trata de nivel molecular), dando la posibilidad de que los enzimas catalicen millones de reacciones en muy poco tiempo. Así explicamos, por ejemplo, el rápido movimiento muscular. Éste se produce a causa de un gran número de microreacciones que provocan una contracción del sarcómero. De esta forma, el conjunto de contracciones de los sarcómeros dan lugar al movimiento tal y como lo conocemos. Se trata pues de reacciones moleculares llevadas a cabo por proteínas, a gran velocidad.
Por tanto, a nivel molecular es muy importante tener en cuenta la cinética enzimática para poder entender el funcionamiento de los seres vivos y su estructura.
Cuando se ha identificado y purificado una nueva proteína, surgen inmediatamente dos preguntas:
Una vez se ha determinado el peso molecular nativo de la proteína, mediante la técnica del equilibrio de sedimentación, la manera más fácil de averiguar el peso o pesos moleculares de las subunidades consiste en utilizar la electroforesis en gel en presencia de SDS.
En estas condiciones, en presencia del SDS, la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas se descomponen todas. La cadena se despliega y se rodea de moléculas SDS. Las numerosas cargas negativas transportadas por las muchas moléculas de SDS unidas a la proteína hacen que la carga que transporta la proteína sea insignificante, quedando la proteína cargada negativamente. La cadena polipeptídica plegada se transforma en un objeto alargado, cuya carga es proporcional a la longitud (y por tanto, al peso molecular) de la cadena. Así pues, no hay ninguna proteína cargada positivamente después de pasar por un baño en SDS, y además la cantidad de carga negativa será independiente de la secuencia de aminoácidos, ya que únicamente dependerá de la longitud de la proteína.
Estas partículas (proteínas cargadas negativamente por efecto del SDS) migrarán en la electroforesis en gel con movilidades relativas, que dependen únicamente de sus longitudes. Entonces, si la electroforesis de la cadena proteica desconocida se lleva a cabo en el mismo gel que un conjunto de estándares de referencia, el peso molecular de la cadena desconocida puede medirse por interpolación en un gráfico. De esta manera conseguimos que las proteínas se separen por peso molecular gracias al efecto de un campo eléctrico que las separa por su cantidad de carga, pero como la carga depende únicamente de la longitud y el peso molecular de la proteína, estas quedan separadas según su peso molecular
Cuando se investigan las subunidades de una proteína mediante esta técnica, es aconsejable realizar dos experimentos: uno en presencia de un agente reductor de enlaces disulfuro como el β-mercaptoetanol y otro en su ausencia. De este modo, se distinguirá entre las subunidades que se mantienen unidas mediante puentes disulfuro y las que se mantienen juntas sólo mediante fuerzas no covalentes.
Suponiendo que el examen indique que hay varias subunidades, ¿hay sólo un tipo o hay varios? La presencia de más de una banda en el gel con SDS es una indicación clara de que hay más de una subunidad. Pero hallar una única banda no demuestra que las subunidades sean idénticas. Porque puede haber varios tipos de subunidades con secuencias de aminoácidos distintas, pero con pesos moleculares idénticos; estas subunidades distintas no pueden diferenciarse con gel SDS. Para dejar claro que sólo está presente un tipo de cadena, se debe recurrir a otros métodos. Por ejemplo, el enfoque isoeléctrico (asilando las subunidades sin detergentes o agentes cariotrópicos) puede ser una técnica muy sensible.
Por lo tanto, hay que aislar estas subunidades y hacer un examen sin modificar su carga para poder así hallar diferentes subunidades en un mismo patrón de bandas en la electroforesis.
Un método muy utilizado en el laboratorio es la electroforesis bidimensional o Western Blot, que consiste en separar las proteínas primero según su punto isoeléctrico, y después según su peso molecular. De esta forma podemos obtener información sobre el tipo de subunidades que presentan las proteínas multiméricas.
En la electroforesis 2D se obtiene una imagen como la que se observa a la derecha.
En los últimos años (2000-actual) se ha aplicado una técnica física antigua, la espectrometría de masas, para el estudio de las proteínas, que ha dado muy buenos resultados.
En el espectrómetro de masas, las moléculas se ionizan y posteriormente se aceleran a través del vacío mediante un campo eléctrico. Las partículas con distinta relación masa/carga se separan mediante su deflexión en un campo magnético o bien midiendo simplemente su tiempo de vuelo hasta un detector.
Cada molécula recibe una carga determinada (normalmente sólo unas pocas unidades electrónicas, + o -) durante su ionización. El campo eléctrico contiene un ánodo (la fuente) y un cátodo, que contiene una pequeña apertura para que pasen las moléculas. El campo eléctrico proporciona a cada molécula una energía cinética proporcional a su carga.
Consideremos dos macromoléculas de masa diferente, cada una de las cuales recibe una unidad de carga positiva. La energía cinética para cada una será la misma, pero sus velocidades serán diferentes, ya que E=1/2m(v^2) (fórmula de la energía cinética). Esto significa que, cuanto mayor sea la molécula, se moverá más lentamente.
De esta forma, midiendo el tiempo de llegada al detector a través de la región de deriva, en el espectrómetro de masas, se puede medir la masa molecular.
Los resultados pueden ser muy exactos, del orden de una parte por 10 000 para moléculas del tamaño de la hemoglobina, lo cual es suficientemente exacto para detectar pequeños cambios de la secuencia de aminoácidos.
La técnica se ha ampliado para poder estudiar moléculas del tamaño de las inmunoglobulinas (alrededor de 150.000 Da).
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