Un micro-ARN o mi-ARN es un ARN monocatenario, de una longitud de entre 21 y 25 nucleótidos, y que tiene la capacidad de regular la expresión de otros genes mediante diversos procesos, utilizando para ello la ruta de ribointerferencia.
Fueron descritos inicialmente en 1993 por Rosalind Lee y colaboradores en el laboratorio de Víctor Ambros, sin embargo el término «micro-ARN» solo se acuñó en 2001 en un conjunto de tres artículos publicados en Science (26 de octubre de 2001). A principios de 2008, análisis computacionales realizados por IBM sugerían la presencia de alrededor de 50.000 micro-ARN diferentes en el genoma humano, cada uno tal vez con alrededor de miles de micro-ARN dianas potenciales.
Una vez descubiertos los siARN y la existencia en las células de proteínas que catalizan la degradación del mARN, los investigadores se preguntaron si los siARN también estaban codificados en el genoma, y empezaron a purificar pequeños ARN (19-25 nt) a partir de diferentes especies animales. Sin embargo, no encontraron siARN, sino los denominados micro-ARN, que se habían identificado anteriormente de forma independiente.
Los micro-ARN son moléculas de ARN transcritas a partir de genes de ADN, pero no son traducidas a proteínas. Se expresan en una amplia variedad de organismos, desde plantas hasta gusanos y humanos. Muchos micro-ARN están bien conservados entre especies, y muchos componentes de la maquinaria de los micro-ARN se han encontrado incluso en arqueas y bacterias, lo que revela que su origen es muy antiguo. Algunos recuentos de micro-ARN en humanos identificaban hasta 800, lo que implicaría que los micro-ARN podrían representar como mínimo el 3% de todos los genes humanos.
La secuencia de ADN que codifica para un gen de micro-ARN tiene una longitud que supera al tamaño final del propio micro-ARN e incluye la región micro-ARN y una región que es complementaria a la anterior, lo que permite su apareamiento. Esto conlleva que, durante la transcripción de esta secuencia de ADN, se forman regiones que tienen la capacidad de formar una horquilla y generar un ARN bicatenario primario largo conocido como pri-micro-ARN. Posteriormente, una enzima nuclear llamada DROSHA corta las bases de la horquilla, formando lo que se denomina pre-micro-ARN. Este pre-micro-ARN es transportado desde el núcleo al citoplasma por la exportina 5. Una vez que el pre-micro-ARN está en el citoplasma es fragmentado por la enzima DICER, que lo corta hasta la longitud final de 20-25 nucleótidos.
La función de los micro-ARN está relacionada con la regulación de la expresión génica. De esta forma un micro-ARN es complementario de una parte de uno o más ARN mensajeros (ARNm). Los micro-ARN de animales suelen mostrar complementariedad imperfecta con la región 3' UTR, y generalmente inhiben la traducción del mARN, mientras que los de plantas suelen mostrar complementariedad perfecta con regiones codificantes e inducen el corte y la posterior degradación del mARN diana (como ocurre con los siARNs en animales).
Antes de clasificarlos como parte de la ruta del iARN, los micro-ARN fueron identificados inicialmente en gusanos, en los cuales regulan las fases del desarrollo, pero en la actualidad se sabe que están implicados en una amplia variedad de procesos del desarrollo y que además podrían tener una función en el establecimiento de redes y en el ajuste fino de la expresión génica en la célula. Dado que el número de dianas potenciales de los micro-ARN aumenta al número de miles (alrededor del 30 % de los genes humanos), los micro-ARN podrían constituir otra capa del circuito regulatorio que existe en las células. Según esto, cualquier desregulación de los micro-ARN podría conllevar grandes problemas regulatorios en la célula, induciendo quizá fenotipos cancerosos. De hecho, se ha mostrado que los perfiles de expresión de los micro-ARN están modificados en un gran número de tipos de cáncer y que la sobreexpresión forzada de los micro-ARN podría conducir al desarrollo de tumores.
Los micro-ARN se transcriben a partir de diferentes localizaciones genómicas como largos tránscritos primarios (pri-micro-ARN) por la ARN-polimerasa II.
Los micro-ARN pueden encontrarse en muchos tipos de loci en el genoma:
Aproximadamente el 50 % de los micro-ARN están en clusters (grupos) de micro-ARN que están inicialmente codificados como un tránscrito policistrónico (que incluye varios genes), que posteriormente se fragmenta en múltiples micro-ARN. En la mayoría de los casos, los micro-ARN policistrónicos comparten el mismo patrón de expresión. Sin embargo, los niveles relativos de los micro-ARN dentro del grupo parecen estar regulados de una manera dependiente del desarrollo y la homeostasis, lo que sugiere una complejidad aún no definida en la regulación de la expresión génica.
Los genes que codifican micro-ARN son mucho más largos que los micro-ARN procesados maduros; los micro-ARN se transcriben inicialmente como tránscritos primarios o pri-micro-ARN con una caperuza en 5' y una cola de poli-adeninas (poly-A) en 3' y se procesan en el núcleo celular en estructuras cortas de 70-nucleótidos en forma de tallo-asa (stem-loop) conocidas como pre-micro-ARN. En animales este procesamiento se realiza por un complejo proteico llamado Microprocesador, que consta de la nucleasa DROSHA y la proteína de unión a ARN de doble hélice, PASHA. Estos pre-micro-ARN son luego procesados a micro-ARN maduros en el citoplasma mediante la interacción con la ribonucleasa DICER, que también inicia la formación del complejo RISC (ARN-induced silencing complex). Este complejo es el responsable del silenciamiento de genes que se observa debido a la expresión de los micro-ARN y a la interferencia de ARN mediada por siARNs. La ruta varía ligeramente en plantas, debido a que carecen de homólogos de DROSHA; en su lugar, sólo homólogos de DICER realizan algunos de los pasos del procesamiento. La ruta también es diferente para los micro-ARN derivados de tallos-asas (stem-loops) procedentes de secuencias intrónicas; en este caso se procesan por DICER pero no por DROSHA. Tanto la hebra sentido como la antisentido del ADN pueden funcionar como molde para producir micro-ARN.
DROSHA (ARNSEN en humanos) es una proteína nuclear de un tamaño entre 130 y 160 kDa (kiloDalton). Contiene los dominios siguientes:
DROSHA funciona en un complejo (Microprocesador), conjuntamente con una proteína de unión a ARN (denominada PASHA en Drosophila o DGCR8 en mamíferos). DGCR8 es una proteína de unión a ADN que reconoce la zona de unión dsARN–ssARN (ARN doble hebra-simple hebra) y posiciona a la ribonucleasa DROSHA a una distancia de 11 nucleótidos (que corresponde a una vuelta de hélice) desde la zona de unión. Por tanto, la función de DGCR8 en el complejo Microprocesador es análoga al dominio PAZ de DICER; DGCR8 proporciona especificidad de sustrato y posiciona adecuadamente el centro de la ribonucleasa DROSHA. Sin embargo, en el caso de DROSHA-DGCR8, el dominio de especificidad está localizado en una cadena polipeptídica separada de los dominios ARNasa III. Se ha propuesto que el dominio WW de unión a prolinas de DGCR8 interacciona con el extremo N-terminal de DROSHA, rico en prolinas. Es posible que DROSHA tenga otras posibles proteínas asociadas que presenten dominios WW que aporten especificidades de sustrato alteARNtivas y funciones biológicas adicionales de DROSHA.
El procesamiento eficiente de los pre-micro-ARN por DROSHA requiere la presencia de largas colas de ARN de hebra simple tanto en el extremo 3' como 5' de la molécula en horquilla. Estos motivos de ARN de hebra simple (ssARN) pueden variar en composición, mientras que su longitud es de gran importancia para que el procesamiento tenga lugar. Un análisis bioinformático de pri-micro-ARN en humanos y moscas identificó regiones estructurales similares, denominadas 'segmentos basales (basal segments)', 'tallos inferiores (lower stems)', 'tallos superiores (upper stems)' y 'asas terminales (terminal loops)'; basándose en estas estructuras conservadas, se han determinado perfiles termodinámicos de los pri-micro-ARN. El complejo de DROSHA (Microprocesador) corta la molécula de ARN ~2 vueltas de hélice a partir del asa terminal y ~1 vuelta de hélice a partir de los segmentos basales. En la mayoría de las moléculas analizadas esta región contiene nucleótidos no apareados y la energía libre del dúplex es relativamente alta en comparación con las regiones tallo superior e inferior [cita requerida]. La mayor parte de los pre-micro-ARN no presentan una estructura de ARN doble hebra (dsARN) perfecta con un asa terminal final. Existen algunas explicaciones posibles para esta selectividad. Una podría ser que dsARN más largos de 21 pares de bases activan la respuesta de Interferón y la maquinaria antiviral de la célula. Otra explicación plausible podría ser que el perfil termodinámico del pre-micro-ARN determina qué hebra será incorporada en el complejo DICER. De hecho, se han detectado claras similitudes entre pri-micro-ARN codificados bien en hebras 5' o 3'.
Una vez generado el pre-micro-ARN, DICER corta el tallo-asa (stem-loop) y se forman dos moléculas complementarias cortas, pero solo una se integra en el complejo RISC (la antisentido), como ocurre con los siARNs. Esta hebra se conoce como la hebra guía, que es seleccionada por la proteína Argonauta, la ARNasa catalíticamente activa en el complejo RISC, en función de la estabilidad del extremo 5'. La otra hebra (la sentido), conocida como anti-guía o hebra pasajera, es degradada por el complejo RISC. Después de su integración en el complejo RISC, ahora activado (ver las notas sobre el complejo RISC en siARNs), los micro-ARN se emparejan de acuerdo con su secuencia de bases con la molécula de ARNm complementaria, y en animales, a diferencia con los siARN, en la mayoría de los casos inducen la inhibición de la traducción de dicho mARN.
Sin embargo, a pesar de que DICER es una enzima fundamental en el procesamiento de los micro-ARN, se ha identificado una ruta de biogénesis de micro-ARN independiente de DICER que utiliza la actividad catalítica de corte de Argonauta2 (Ago2). Así, a diferencia de otros micro-ARN, los niveles de algunos micro-ARN (miR-451-5', miR-2190-5', miR-2190-3', y miR-735-5') no se alteran en mutantes con pérdida de función de DICER, pero disminuyen en mutantes MZago2 (cigótico mateARNl). En el caso de miR-451 (un micro-ARN implicado en la diferenciación de la línea eritroide), el procesamiento de pre-miR-451 requiere la actividad catalítica de Ago2 in vivo. Los mutantes MZago2 muestran un retraso en la eritropoyesis que puede rescatarse utilizando Ago2 de tipo salvaje o con dúplex de miR-451, pero no con Ago2 catalíticamente inactiva. Por ello, se ha sugerido que Ago2 es capaz de generar micro-ARN funcionales independientemente de Dicer. Resultados similares se han observado en organismos diferentes.
Como se indica en el caso de los siARN, todavía no está claro cómo el complejo RISC activado localiza los mARN complementarios en el interior celular. Las proteínas Argonauta, los componentes catalíticos de RISC, están localizadas en regiones específicas del citoplasma denominadas P-bodies (cuerpos-P, o cuerpos citoplásmicos o cuerpos GW, porque contienen la proteína GW182), los cuales son regiones con altas tasas de degradación de mARN; también se ha detectado actividad micro-ARN en los P-bodies. La alteración de los P-bodies disminuye la eficiencia del proceso de iARN, lo que sugeriría que los P-bodies podrían ser un lugar crítico para el proceso de iARN. Sin embargo, estudios posteriores han demostrado que los P-bodies no son imprescindibles para el proceso de iARN, ya que células sin P-bodies pueden producir silenciamiento tanto con siARN como con micro-ARN.
A pesar del importante progreso realizado en la comprensión de la biogénesis y la función de los micro-ARN, los mecanismos utilizados por los micro-ARN para regular la expresión génica permanecen bajo un intenso debate. En efecto, existen trabajos publicados que indican que los micro-ARN en células animales reprimen la expresión génica de cuatro formas diferentes:
Además, los micro-ARN en animales pueden inducir una degradación significativa de los mARN diana (como los micro-ARN de plantas), a pesar del apareamiento imperfecto mARN-micro-ARN. Sin embargo, el mecanismo de degradación suele ser diferente: los micro-ARN inducen la degradación de los mARN diana mediante la eliminación de la caperuza (en el extremo 5') y de la cola de poliadeninas (poly-A, en el extremo 3'). Finalmente, los miARN podrían también silenciar sus mARN dianas secuestrándolos en loci (sitios) citoplásmicos discretos, los cuerpos de procesamiento de mARN o P bodies, que carecen de maquinaria de traducción. Sin embargo, a pesar de las discrepancias existentes entre los diferentes mecanismos propuestos, los apoyos experimentales para cada mecanismo son variados, y son el objeto actual de intensos estudios, para tratar de elucidarlas. Se ha sugerido que las diferencias observadas se deben a deficiencias en los experimentos realizados, en algunos casos originadas por la utilización de modelos erróneos en los estudios de regulación de la traducción.
Por último, en estudios recientes se ha detectado que en determinadas condiciones, los micro-ARN pueden también activar la síntesis proteica.
Características generales de los micro-ARN:
Los micro-ARN pueden funcionar como supresores de tumores o como oncogenes; queda por demostrar su influencia concreta en cada tipo de cáncer. De hecho, un estudio mostró que cerca del 50 % de los micro-ARN anotados en humanos están localizados en áreas del genoma conocidas como sitios frágiles, que están asociadas con el desarrollo de cáncer.
La expresión de ciertos micro-ARN está correlacionada con varios tipos de cáncer, por lo que funcionarían como oncogenes. Por ejemplo, un informe de Sonoki y colaboradores relacionó el gen mir-125b-1 con leucemia, y describió un paciente con leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B que portaba una inserción del pre-micro-ARN en el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Aunque los investigadores no pudieron determinar cómo se modulaba la expresión de mir-125b-1 en las células tumorales, este estudio apoya el papel de este gen como un oncomir.
La primera indicación de que los micro-ARN podrían funcionar como supresores de tumores proceden de un informe de Calin y colaboradores que mostraba que pacientes diagnosticados con una forma frecuente de leucemia en adultos (leucemia linfoide crónica de las células B o LLC), presentan a menudo deleciones o sub-regulación (downregulation) de dos genes de micro-ARN presentes en un clúster, mir-15a y mir-16-1. Deleciones dentro del locus 13q14 ocurren en más del 65 % de los casos de LLC, y en más del 50 % de los linfomas de las células del manto, el 16–40 % de los mielomas múltiples y el 60 % de los cánceres de próstata. Por tanto, se predijo que un gen supresor de tumores debía residir en esta región de 30-kb. Es interesante notar que mir-15a y mir-16-1 mapean dentro del intrón de un gen de ncARN (non-coding ARN, ARN no codificante) para proteína, de función desconocida, denominado LEU2. Por otro lado, algunos estudios establecen una conexión entre la reducción de la expresión de let-7 (que regula la proliferación y diferenciación celular en C. elegans) y el incremento de la tumorigénesis y el pronóstico grave de los pacientes afectados. Además, durante el desarrollo normal, LIN28 (un promotor de pluripotencia) puede prevenir la acumulación de let-7. De acuerdo con estos resultados, se ha propuesto que let-7 regularía la troncalidad (stemness) de las células, reprimiendo la auto-renovación y promoviendo la diferenciación, tanto durante el desarrollo normal como en cáncer.
Por otro lado, se ha observado además que los micro-ARN contribuyen a la progresión maligna del cáncer, específicamente mediando la invasión tumoral y la formación de metástasis.
Por ejemplo, en C. elegans, los micro-ARN permiten un paso rápido a través de las diferentes fases del desarrollo: los micro-ARN lin-4 y let-7 controlan el momento en los que se define el destino de las células neuronales e hipodérmicas durante el desarrollo larvario. lin-4, let-7 y otros genes de micro-ARN están conservados en mamíferos, y su función potencial en el desarrollo embrionario de mamíferos están bajo estudio activo. En C. elegans, los niveles de expresión de LIN-14 y LIN-28 disminuyen debido a la expresión del ARN de lin-4 al final del primer estadio larvario, para permitir la progresión a estadios larvarios posteriores. En los estadios larvarios finales, la expresión de LIN-41 y otros genes podría verse reducida por la expresión del ARN de let-7, liberando la represión de la expresión de la proteína LIN-29 y permitiendo la progresión al estadio adulto. Dado que el ARNm de lin-29 no posee sitios complementarios al ARN de let-7, probablemente lin-29 no es una diana directa de let-7.
Por otro lado, en miocitos de mamíferos, la activación del factor de transcripción SRF induce la expresión de miR-1–1 y miR-1–2, que a su vez reprime la expresión del factor de transcripción Hand2 y el ligando de Notch, Delta, afectando por tanto la expansión de las células progenitoras o su diferenciación. SRF también induce la expresión de miR-133a-1 y miR-133a-2, lo que inhibe a su vez SRF en un lazo de retroalimentación (feedback loop). En músculo opera una ruta similar, excepto que la inhibición por retroalimentación de Mef2 y MyoD ocurre cuando la expresión de HDAC4 está reducida debido al silenciamiento ejercido por miR-1–1 y miR-1–2.
Uno de los primeros micro-ARN detectados con una función en el desarrollo del sistema inmune fue miR-181a; este micro-ARN se expresa en altos niveles en las células del timo y en niveles menores en las células del corazón, los nódulos linfáticos y la médula ósea. En la médula ósea, miR-181a se expresa en niveles mayores por células B B220+ B que por células T CD3+. Específicamente, la expresión de miR-181a en células B derivadas de la médula ósea disminuye durante la maduración de las células B desde el estadio del desarrollo de pro-célula-B al estadio pre-célula-B. Además, la expresión ectópica de miR-181a en células enriquecidas en células madre y progenitoras hematopoyéticas resultó en un incremento en el porcentaje de células B CD19+ y un descenso en el porcentaje de células T CD8+ en ensayos de reconstitución de la médula ósea a corto plazo en ratones, demostrando que la especificidad de líneas celulares de los micro-ARN podría tener una función en la regulación del desarrollo de los linfocitos.
Por otro lado, también se ha detectado una distribución espacial de los micro-ARN: en embriones del pez cebra (zebrafish), los patrones de localización de micro-ARN individuales indican que su actividad podría estar limitada a los tejidos y órganos en los que se expresan. Por ejemplo, miR-206 se expresa sobre todo en el músculo, miR-126 en los vasos sanguíneos y el corazón, miR-200a en el sistema de la línea lateral (un sistema mecanosensorial que detecta el movimiento del agua) y órganos sensoriales, y miR-30c en el precursor de los riñones.
Dos estudios independientes en 2007 en ratones indican que una cantidad significativa de micro-ARN maternos se heredan por los zigotos, y que dichos micro-ARN maternos podrían tener un papel importante en las etapas tempranas del desarrollo embrionario (efecto materno).
Estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se han empleado para identificar ciertos micro-ARNs que modulando la traducción del mARN funcionan como reguladores cruciales del colesterol, triglicéridos y homeostasis energética en el organismo.
Los micro-ARNs implicados en control metabólico y asociados a trastornos cardiometabólicos son: miR-128-1, miR-148a, miR-130b y miR-301b. Siendo los dos primeros los más relevantes en esta acción, ya que la introducción de precursores de estos micro-ARNs en células hepáticas humanas desencadenó una menor expresión del gen para el receptor de LDL y ABCA1 (ATP-binding cassette A1). Por el contrario, con la introducción de anti-micro-ARNs de estos, aumentaba la expresión del receptor de LDL y ABCA1.
El receptor de LDL capta LDL-colesterol, tiene papel, por tanto, en la depuración hepática y en la prevención de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares. Y estos micro-ARNs afectan a su expresión, disminuyéndola.
ABCA1 es un componente crítico en la ruta del colesterol total, ya que facilita la producción de HDL de novo en hígado e intestino, el cual es el responsable de eliminar el colesterol de las células periféricas y transportarlo al hígado para su excreción. estos micro-ARNs afectan a su expresión, y por tanto, a la salida de colesterol de las células para ser excretado. por el contrario, anti-micro-ARNs de estos, favorecen la expresión de ABCA1, produciendo mayores cantidades de HDL.
La sobreexpresión miR-128-1 y miR-148a principalmente, reduce fuertemente los niveles hepáticos de ABCA1 y LDL-R. También, miR 128-1 altera la expresión de IRS1 (receptor de insulina) contribuyendo a la resistencia a insulina, y micro-ARN-148a altera la expresión de CPT1A. El perfil de colesterol y lípidos circulantes en ratones que sobreexpresan estos micro-ARNs reveló una marcada reducción de los niveles plasmáticos de HDL-C en comparación con los controles. Debido a que se necesita ABCA1 para su síntesis, y este ha disminuido con la introducción de los micro-ARNs. Todo esto se revierte al introducir anti-micro-ARNs, por tanto, estos podrían ser aplicados en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la homeostasis, sensibilidad glucídica, señalización de la insulina, triglicéridos y colesterol en sangre.
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